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細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟

更新時(shí)間:2022-09-08 00:00:00       點(diǎn)擊次數(shù):5280

    細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)目的:研究趨化因子或其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞侵襲的影響。

一、準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)以及包被

  從冰箱中取出Assembling tool 以及 CIM plate 上板。拆開(kāi)上板,可見(jiàn)板上和蓋子上均有藍(lán)點(diǎn)標(biāo)記,把板放在 Assembling tool 上。

  1、首先進(jìn)行 Matrigel 包被,每孔內(nèi)加入 50 µl matrigel ,每做完一個(gè)梯度,即 4 個(gè)孔后, 馬上從孔內(nèi)輕輕吸出 30µl Matrigel。

  2、空白對(duì)照的四個(gè)孔同樣加入 50µl 的無(wú)血清培養(yǎng)基,然后吸出 30µl。

  3、蓋上蓋子,將整個(gè) Assambling tool 連同板子 ,放入培養(yǎng)箱中孵育 4-5 小時(shí),使 Matrigel凝結(jié)。

二、組裝 RTCA CIM Plate-16 以及測(cè)量 CI 背景值

  1、取出CIM plate 下板,放在 Assambling tool 第二個(gè)槽內(nèi),下板中加入160µl 預(yù)溫好的完全培養(yǎng)基。將 CIM-Plate 16 Assembly Tool 旋轉(zhuǎn) 90 度,將上板拿起,水平移到下板上方,檢查安裝是否緊扣在一起。

  2、在上板中每孔加入 30 µl 無(wú)血清培養(yǎng)基,蓋上上板蓋子將整塊 CIM-Plate 16 放入 RTCA DP 分析儀。放在培養(yǎng)箱中平衡一個(gè)小時(shí)。

  3、一小時(shí)后,進(jìn)入 schedule 頁(yè)面,點(diǎn)擊開(kāi)始按鈕。背景值測(cè)完后,顯示 ready for starting next step.回到Message 頁(yè)面,看是否有任何報(bào)錯(cuò)信息。

三、準(zhǔn)備細(xì)胞,并加入 RTCA CIM Plate-16 上腔

  1、取出CIM plate,重新放回到超凈臺(tái)中的 Assambling tool 上,每孔加入 100 微升含 20000 個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。

  2、為了避免培養(yǎng)箱內(nèi)由于溫差產(chǎn)生蒸騰作用而引起邊緣效應(yīng),將 CIM 培養(yǎng)板,在常溫下靜置半個(gè)小時(shí)。
四、運(yùn)行實(shí)驗(yàn)

  將 CIM plate 重新放回RTCA DP 分析儀上,看到提示 plate scanned, connection is OK 后,點(diǎn)擊開(kāi)始第二步。這時(shí)機(jī)器開(kāi)始每 15 分鐘檢測(cè)一次孔內(nèi)細(xì)胞的遷移的情況。

五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

  在 Cell Plot 頁(yè)面,選擇顯示平均值以及標(biāo)準(zhǔn)差,點(diǎn)擊 add ,可見(jiàn)不同組得到的實(shí)驗(yàn)信號(hào)。當(dāng) Matrigel 濃度較大時(shí),細(xì)胞侵襲越困難,而無(wú)血清培養(yǎng)基對(duì)照孔內(nèi),細(xì)胞侵襲的信號(hào)就非常明顯。根據(jù)包被 Matrigel 的濃度由高到低,細(xì)胞侵襲能力逐漸增強(qiáng)。

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